name: Модуляция связывающей и эстеразной активности сывороточного альбумина
keyword_list: жирные кислоты сайт Садлоу II сайт Садлоу I эстеразная активность альбумин
abstract: В настоящей работе впервые методом 1Н ЯМР показано, что сывороточный альбумин обладает истинно эстеразной активностью по отношению к НФА и НФП. Нами показано, что скорость образования продуктов гидролиза НФА и НФП в присутствии БСА выше, чем в случае их спонтанного гидролиза. Образование продуктов истинно эстеразной активности БСА (ацетата в случае НФА и пропионата в случае НФП) начинается не позднее, чем через 10 минут после добавления раствора субстрата к раствору белка. Известно, что период полураспада ацетилированного тирозина в основном сайте псевдоэстеразной активности альбумина Садлоу II составляет 61±4 ч. Совокупность этих фактов свидетельствует о наличии в молекуле альбумина центра истинно эстеразной активности, отличного от сайта псевдоэстеразной активности. Методами молекулярного моделирования мы показали, что сайт Садлоу I БСА с каталитическим Tyr149 (Tyr150 в ЧСА) является наиболее вероятным кандидатом на эту роль. 
  В эксперименте in vitro окисление тиоловой группы Cys34 БСА усиливает связывание НФА в сайте Садлоу I, но уменьшает значение Vmax. В эксперименте in silico окисление тиоловой группы влияет на конформацию параоксона в сайте Садлоу I БСА и усиливает связывание лиганда в сайте. Мы полагаем, что стабильность продуктивных комплексов отражает соотношение констант скорости k1 , k2 , k3 , k-1 и k-2 , согласно схеме 1 определяющих значение KMapp: чем стабильнее продуктивная конформация и меньше значение distC-O, тем выше сродство (аффинность) и прочность фермент-субстратного комплекса, т.е. (k1 + k2) >> (k-1 + k-2) ≈ k3. В этом ключе наши данные in silico согласуются с данными in vitro для сайта Садлоу I БСА и для НФА или параоксона в качестве субстратов. В эксперименте in vitro окисление тиоловой группы Cys34 БСА ослабляет связывание НФА в сайте Садлоу II, но не влияет на скорость реакции. В эксперименте in silico окисление тиоловой группы не влияет на конформацию параоксона в сайте Садлоу II БСА и не оказывает существенного влияния на сродство сайта к параоксону; вероятно, в данном случае (k1 + k2) ≈ (k-1 + k-2) >> k3. При исследовании ЧСА в нашем эксперименте in silico окисление Cys34 влияло на конформацию параоксона в сайте Садлоу I, но не влияло на сродство сайта к лиганду; предложен баланс (k1 + k2) > (k-1 + k-2) > k3. Так же, как и для БСА, окисление тиоловой группы не влияло на конформацию параоксона в сайте Садлоу II и не влияло на сродство сайта к лиганду. Согласно литературным данным, в условиях in vivo окисление альбумина оказывает существенное влияние на его связывающие свойства в обоих сайтах Садлоу. В условиях in vivo альбумин связан с ЖК, и таким образом, ЖК, по всей видимости, играют важную роль в регуляции антиоксидантных свойств альбумина. Впервые к такому выводу пришли Грызунов с соавторами (Gryzunov et al., 2003). Связывание ЖК создает предпосылки для одновременной регуляции двух важных функций белка: транспортной и антиоксидантной. 
  Согласно полученным нами данным, ЖК обладают наиболее выраженным ингибирующим действием в отдаленный период процесса гидролиза НФА в присутствии БСА, то есть оказывают ингибирующий эффект на эстеразную активность альбумина в сайте Садлоу I. Иной результат был получен для ЧСА и КСА. ОК способна оказывать ингибирующее влияние на псевдокаталитическую активность сайта Садлоу II альбуминов человека и крысы. Анализ данных выявил неконкурентный тип ингибирования. При этом не было выявлено эффекта ингибирования эстеразной реакции в сайте Садлоу I. Полученные в представленном исследовании данные в очередной раз подтверждают тот факт, что функциональные характеристики ЧСА и КСА отличаются между собой в меньшей степени по сравнению с функциональными характеристиками БСА (Goncharov et al., 2017). Методами молекулярного моделирования было показано, что основные изменения в значениях свободных энергий связывания вносит энергия вандерваальсовых сил.
  Анализ данных, полученных при инкубировании БСА с НФА в присутствии ЭГКГ, выявил активирующее влияние ЭГКГ на скорость гидролиза НФА альбумином. Действие ЭГКГ на скорость гидролиза параоксона бычьим альбумином оказалось схожим с НФА: активность обоих сайтов альбумина значительно усиливалась. По данным молекулярного моделирования полифенол резвератрол существенно не влияет на эффективность связывания параоксона в сайте Садлоу II. Полученный результат указывает на то, что сайт Садлоу II альбумина слабо подвержен аллостерической модуляции полифенолами, связывающимися в сайте Садлоу I. Поэтому воздействовать на альбумин (на сайт Садлоу I) можно лишь теми полифенолами, которые могут связываться и в сайте Садлоу II, как ЭГКГ. Полученный результат частично объясняет некоторый защитный эффект ЭЗЧ при отравлении ФОС (Гончаров и др., 2019). 
  Как отмечалось выше, концентрация диазепама, при которой он может оказывать модулирующий эффект на альбумин, существенно превышает терапевтическую концентрацию диазепама в плазме крови. Однако в биохимических экспериментах диазепам нередко используют в качестве специфического ингибитора сайта Садлоу II, и тот факт, что этот бензодиазепин может влиять на связывающую активность сайта Садлоу I, следует принимать во внимание при проведении экспериментов in vitro. Карбоксим же, напротив, при отравлении ФОС вводится в концентрациях, сопоставимых с концентрацией альбумина в кровеносном русле. Поэтому его активирующий эффект на (псевдо)эстеразную активность белка представляет большой интерес и достоин дальнейшего изучения.
  Без сомнения, применяемые в данной работе методики имеют ряд ограничений. Так, с помощью метода ЯМР можно качественно увидеть выход продукта истинно эстеразной реакции, катализируемой альбумином, однако стандартные настройки не позволили нам количественно определить кинетические характеристики данной реакции. Требуется кропотливый подбор параметров сканирования, который бы позволил с наименьшей погрешностью количественно оценить кинетические параметры эстеразной активности альбумина с помощью ЯМР. Что касается проведенных биохимических экспериментов, в них мы не учитывали такое явление как молекулярный краудинг. В живых системах, в отличие от экспериментов in vitro, биохимические процессы протекают в среде, содержащей высокие концентрации макромолекул (50–400 мг/мл). В частности, в плазме крови человека плотность белковых макромолекул в норме достигает 90 мг/мл. Из-за плотной среды объем доступного растворителя уменьшается, что может повлиять на структуру белка, укладку, форму, конформационную стабильность, ферментативную активность, на связывание малых молекул, взаимодействие белков между собой и с нуклеиновыми кислотами, может вызвать патологическую агрегацию (Kuznetsova et al., 2014). В связи с этим стоит подчеркнуть важность разработки тест-систем, моделирующих активность альбумина в условиях молекулярного краудинга. Компьютерное моделирование также имеет ряд ограничений. Для расчета энергии системы наиболее широко используется метод молекулярной механики, который не позволяет адекватно смоделировать образование и разрыв ковалентных связей, таутомеризацию, изменение состояния протонирования в процессе симуляции. Основные ограничения в расчете свободной энергии связывания связаны с отсутствием точных оценок энергии сольватации и энтропии. Поэтому только совместное применение расчетных и экспериментальных методик, которые дополняют и уточняют друг друга, могут дать полное представление о взаимодействии биологических молекул.
chairman_dissertation_council.name: Елена
chairman_dissertation_council.surname: Чуян
chairman_dissertation_council.patronymic: Николаевна
chairman_dissertation_council.position: Заведующая кафедрой физиологии человека и животных и биофизики
chairman_dissertation_council.degree: Доктор биологических наук
chairman_dissertation_council.rank: Профессор
chairman_dissertation_council.wos_research_id: Т-1950-2017
chairman_dissertation_council.scopus_author_id: 9436061900
chairman_dissertation_council.rinc_id: 814721
chairman_dissertation_council.url: https://ibtef.cfuv.ru/чуян-елена-николаевна/
chairman_dissertation_council.orcid: 0000-0001-6240-2732
chairman_dissertation_council.territory: РОССИЯ
organization_supervisor.name: Анатолий
organization_supervisor.surname: Кубышкин
organization_supervisor.patronymic: Владимирович
organization_supervisor.position: проректор по научной деятельности
organization_supervisor.territory: РОССИЯ
rubrics.code: 31.27.25
rubrics.name: Биохимия животных
rubrics.code: 31.27.17
rubrics.name: Энзимология
oecds.code: 01.06.CQ
oecds.name: BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
speciality_codes.name: Биохимия
speciality_codes.code: 03.01.04
supervisors.fio: Гончаров Н.В.
supervisors.scientific_degree: Доктор биологических наук
supervisors.speciality_code: Биохимия
supervisors.responsible_type: Научный руководитель
opponents.fio: Муронец В. И.
opponents.scientific_degree: Доктор биологических наук
opponents.speciality_code: Биохимия
opponents.responsible_type: Оппонент
opponents.fio: Соколов А.В.
opponents.scientific_degree: Доктор биологических наук
opponents.speciality_code: Биохимия
opponents.responsible_type: Оппонент
protection_organization.name: ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "КРЫМСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ В.И. ВЕРНАДСКОГО"
protection_organization.ogrn: 1149102048578
protection_organization.supervisor_name: АНДРЕЙ
protection_organization.supervisor_surname: ФАЛАЛЕЕВ
protection_organization.supervisor_patronymic: ПАВЛОВИЧ
protection_organization.organization_type: Организация
protection_organization.okogu: Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
protection_organization.okopf: Федеральные государственные автономные учреждения
author_organization.name: ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «ДОНСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»
author_organization.ogrn: 1026103727847
author_organization.supervisor_name: БЕСИК
author_organization.supervisor_surname: МЕСХИ
author_organization.supervisor_patronymic: ЧОХОЕВИЧ
author_organization.organization_type: Организация
author_organization.okogu: Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
author_organization.okopf: Федеральные государственные бюджетные учреждения