name: Функциональная активность мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток человека различного генеза в условиях провоспалительного окружения
keyword_list: цитокины IDO микроокружение кожная рана ММСК
abstract: Объект исследования: мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) постнатальных тканей человека, выделенные из костного мозга, жировой ткани, кожи взрослого человека и пуповины новорожденного, а также дифференцированные из индуцированных стволовых клеток человека (ИПСК).
  Цель: идентификация и характеристика молекулярных механизмов индукции функциональной активности ММСК человека различного генеза в условиях провоспалительного микроокружения для поиска перспективных подходов клеточной и лекарственной терапии при заболеваниях, характеризующихся нарушениями процессов заживления ран.
  Методы: фазово-контрастная и флуоресцентная микроскопии, иммуногистохимический и иммуноцитохимический анализы, иммуноферментный анализ, иммуноблоттинг, проточная  цитометрия, методы оценки цитотоксичности (МТT и ЛДГ-тесты), ПЦР в режиме реального времени, мультплексный анализ, планиметрия, лазерная допплеровская флоуметрия, измерение транскутанного напряжения кислорода тканей, статистический анализ данных.
  Аппаратура: люминесцентный инвертированный микроскоп Zeiss Axiovert 200 (Carl Zeiss, Германия), амплификатор iQ™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, США),  Цитофлюориметр FACS CANTO II (BD biosciences, США), мультидетектор ZENYTH 3100 (Anthos Labtec, Австрия), модуль Mini Trans-Blot® Cell system (Bio-Rad, США), иммуноанализатор Bio-Plex 200 (Bio-Rad, США).
  Показано, что культивируемые ММСК, выделенные из пуповины новорожденного, кожи, костного мозга и жировой ткани взрослого человека, обладают сходными свойствами по экспрессии поверхностных маркеров CD73, CD90, CD105 и способности дифференцироваться в адипогенном, хондрогенном и остеогенном направлениях. Выявлено преимущество ММСК пуповины новорожденного перед ММСК взрослого человека, связанное с пропорционально более высоким содержанием  прогениторных клеток, экспрессирующих   нестин  и CD117. 
  Обнаружено, что в смешанных культурах ММСК способны угнетать пролиферацию активированных мононуклеарных клеток периферической крови (актМПК) независимо от наличия или отсутствия контактных взаимодействий между ними. Подавление пролиферации актМПК в присутствии ММСК связано со снижением количества CD4+ Т-лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы к IL-2 и сопровождается изменением цитокинового микроокружения, которое выражается в увеличении концентраций интерлейкинов IL-1, IL-6, IFN-γ, G-CSF и снижении концентраций IL-10, IL-13 в супернатантах по сравнению с раздельными культурами этих клеток.
   Активация МПК фитогемагглютинином приводит к увеличению доли CD45+СD3+ Т-лимфоцитов, образовывающих плотные адгезионные контакты с ММСК в противоположность клеткам субпопуляции СD45+CD3- (не Т-лимфоцитов), у которых такая способность снижается. Обнаружено, что среди субпопуляций Т-лимфоцитов способность связываться с ММСК при активации увеличивается у субпопуляции СD4+ Т-лимфоцитов. В тоже время у CD8+ Т-лимфоцитов такая способность не изменяется. Установление межклеточных контактов между ММСК и СD4+ Т-лимфоцитами происходит при взаимодействии рецепторных пар Т-клеточного интегрина LFA1 и молекулы межклеточной адгезии 1 (ICAM-1) на ММСК, и Т-лимфоцитарный антиген 4 (CTLA4)/CD28 на поверхности CD4+Т-лимфоцитов и CD80/CD86 на ММСК. Обнаружено, что адгезионные контакты между ММСК и актМПК участвуют в регуляции синтеза IL-1, IL-6 и G-CSF.
  Установлено, что культивируемые ММСК исходно обладают  провоспалительным  фенотипом,  конститутивно продуцируя на высоком уровне IL-6, IL-8, MCP-1 и PGE2. Сигналы, поступающие от провоспательного микроокружения, вызывают в ММСК фенотипические изменения, выражающиеся в индукции синтеза фермента IDO. Показано, что при взаимодействии с актМПК в ММСК осуществляется перекрестная регуляция экспрессии IDO. Рецепторное взаимодействие молекул HLA-DR и костимуляторных молекул CD80/CD86 на ММСК с их контррецепторами на Т-лимфоцитах играет основную роль в индукции синтеза и функциональной активности IDO в ММСК. А связывание молекул адгезии ICAM-1 на ММСК с интегрином LFA-1 на поверхности T-лимфоцитов приводит к увеличению секреции IFN-γ клетками, и играет опосредованную роль в индукции синтеза IDO в ММСК через воздействие IFN-γ. Воздействие растворимого IFN-γ и рецепторное взаимодействие ММСК и CD4+ Т-лимфоцитов  образуют регуляторную петлю с положительной обратной связью, которая способствует изменению цитокинового микроокружения,  подавлению активации и пролиферации иммунных клеток, и, как следствие, затуханию воспалительного процесса.  
  При взаимодействии с аллогенными мононуклеарными клетками периферической крови ММСК характеризуются саморегулирующейся экспрессией поверхностных молекул главного комплекса гистосовместимости I класса, что определяет возможность их уклонения от атаки клеток иммунной системы реципиента при трансплантации и является фундаментальным подтверждением возможности терапевтического использования ММСК для аллогенных трансплантаций.  В результате проведенного открытого рандомизированного плацебо-контролируемого ограниченного пилотного исследования установлено, что введение суспензии ММСК пуповины новорожденного подкожно по периферии раны и в дно раневого дефекта у пациентов с хроническими ранами различной этиологии стимулирует  рост и созревание грануляционной ткани, приводит к улучшению показателей микроциркуляции крови в ране, ускорению эпителизации в раневом дефекте, и создает благоприятные условия для естественного заживления или проведения аутодермопластики расщепленным лоскутом. Показано, что применение препарата ММСК в форме суспензии является безопасным и эффективным методом в лечении длительно незаживающих ран. Полученные данные могут стать основой для дальнейших исследований по использованию ММСК не только в терапии хронических ран, но и других заболеваний, характеризующихся развитием хронического воспаления.
  Для преодоления проблем образования рубцовой ткани у взрослого человека предложен оригинальный подход к изучению молекулярных механизмов регенерации фетальных тканей, которые способны к полноценному восстановлению в короткие сроки. Разработаны методы получения клеток примитивной мезодермы   и ММСК из одного источника с использованием двухстадийной дифференцировки индуцированных плюрипотенетных стволовых клеток (ИПСК) человека в мезодермальном направлении. Впервые установлены морфофункциональные отличия клеток параксиальной мезодермы эмбриона человека от постнатальных ММСК по экспрессии мРНК транскрипционного фактора BRY, генов SNAI1, TBX6, MIXL1 и экспрессии поверхностных маркеров CD73 и CD105.
  Таким образом, были разработаны и охарактеризованы  культуры мезодермальных стромальных клеток, соответствующих разным стадиям развития человека, от эмбрионального до взрослого; установлены молекулярные механизмы подавления пролиферации активированных иммуных клеток под действием ММСК, посредством установления межклеточных контактов через взаимодействие рецепторных пар и молекул адгезии CD80/CD86 и ICAM-1 на поверхности ММСК и CTLA4/CD28 и LFA1 на поверхности СD4+Т-лимфоцитов (соответственно), образующих регуляторную петлю с обратной положительной связью, способствующей затуханию воспалительного процесса; обнаружена способность ММСК модулировать цитокиновое микроокружение и смещать баланс в пользу регенерации; а также подтверждение эффективности суспензии ММСК в лечении хронических ран в клинических исследованиях.
  В перспективе, новые данные, полученные в данной работе, позволят отказаться от дорогостоящих технологий создания биомедицинских клеточных продуктов и получить менее затратные инновационные субстанции лекарственных средств на основе биологически активных молекул  и современных синтетических полимеров и наноматериалов, способных радикально изменить специфические генетически контролируемые ответы клеток на поступающие сигналы и осуществить селективные фенотипические эффекты в механизмах передачи сигналов в организме для стимуляции регенеративных процессов в тканях при многих заболеваниях.
  Область применения: теоретическая и практическая биология и медицина.
chairman_dissertation_council.name: Людмила
chairman_dissertation_council.surname: Михалёва
chairman_dissertation_council.patronymic: Михайловна
chairman_dissertation_council.position: Директор НИИ морфологии человека им. акад. А.П. Авцына
chairman_dissertation_council.degree: Доктор медицинских наук
chairman_dissertation_council.rank: Член-корреспондент РАН
chairman_dissertation_council.wos_research_id: AAG-8330-2019
chairman_dissertation_council.scopus_author_id: 6701472396
chairman_dissertation_council.orcid: 0000-0003-2052-914X
chairman_dissertation_council.territory: РОССИЯ
organization_supervisor.name: Констанин
organization_supervisor.surname: Котенко
organization_supervisor.patronymic: Валентинович
organization_supervisor.position: Директор
organization_supervisor.territory: РОССИЯ
rubrics.code: 76.03.33
rubrics.name: Медицинская цитология
rubrics.code: 76.03.35
rubrics.name: Медицинская гистология
oecds.code: 01.06.DR
oecds.name: CELL BIOLOGY
speciality_codes.name: Клеточная биология
speciality_codes.code: 1.5.22.
supervisors.fio: Киселёв С.Л.
supervisors.scientific_degree: Доктор биологических наук
supervisors.speciality_code: Молекулярная генетика
supervisors.responsible_type: Научный руководитель
opponents.fio: Гольдштейн Д.В.
opponents.scientific_degree: Доктор биологических наук
opponents.speciality_code: Клеточная биология, цитология, гистология
opponents.responsible_type: Оппонент
opponents.fio: Глухов А.И.
opponents.scientific_degree: Доктор биологических наук
opponents.speciality_code: Биохимия
opponents.responsible_type: Оппонент
opponents.fio: Малашичева А.Б.
opponents.scientific_degree: Доктор биологических наук
opponents.speciality_code: Клеточная биология, цитология, гистология
opponents.responsible_type: Оппонент
protection_organization.short_name: ФГБНУ "РНЦХ ИМ. АКАД. Б.В. ПЕТРОВСКОГО"
protection_organization.name: ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "РОССИЙСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ХИРУРГИИ ИМЕНИ АКАДЕМИКА Б.В. ПЕТРОВСКОГО"
protection_organization.ogrn: 1027739267214
protection_organization.supervisor_name: КОНСТАНТИН
protection_organization.supervisor_surname: КОТЕНКО
protection_organization.supervisor_patronymic: ВАЛЕНТИНОВИЧ
protection_organization.organization_type: Организация
protection_organization.okogu: Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
protection_organization.okopf: Федеральные государственные бюджетные учреждения
author_organization.short_name: ИОГЕН РАН
author_organization.name: ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ ИМ. Н.И. ВАВИЛОВА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК
author_organization.ogrn: 1037739549748
author_organization.supervisor_name: АЛЕКСАНДР
author_organization.supervisor_surname: КУДРЯВЦЕВ
author_organization.supervisor_patronymic: МИХАЙЛОВИЧ
author_organization.organization_type: Организация
author_organization.okogu: Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
author_organization.okopf: Федеральные государственные бюджетные учреждения