name: Клеточная модель митохондриальной дисфункции при атеросклерозе
keyword_list: митохондрии гетероплазмия атеросклероз цибридные линии
abstract: Объект исследования: клеточная линия THP-1 и митохондрии из тромбоцитов пациентов, а также созданные на их основе цитоплазматические гибриды, аутопсийный материал (интима аорты, сосочковые мышцы миокарда, паренхима печени, паренхима селезенки, скелетная мускулатура), биопсийный материал (цельная кровь и отдельные фракции лейкоцитов (нейтрофилы, лимфоциты, моноциты) и буккальный эпителий). Предмет исследования – митохондрии и однонуклеотидные мутации митохондриальной ДНК, ассоциированные с атеросклерозом (m.12315G>A и m.13513G>A,  m.1555А>G, m.3256C>T и m.3336T>C). 
  Цель: создать клеточную модель митохондриальной дисфункции при атеросклерозе и изучить особенности распределения и вариабельности мутантных аллелей митохондриального генома в различных тканях и клетках человека. 
  Методы: культуральные методы, которые позволили создать цитоплазматические гибриды: ПЭГ-слияние, выделение тромбоцитов, культивирование клеток в контролируемых условиях среды; цитологические методы, использованные для изучения клеточной модели: измерение мембранного потенциала и совокупной массы митохондрий с помощью конфокальной микроскопии; и биохимические методы, позволившие провести сравнительный анализ клеточного дыхания. Генетические методы, которые позволили определить уровень мутационной нагрузки митохондриального генома в различных типах клеток и тканей человека: выделение ДНК методом фенол-хлороформной экстракции, метод полимеразной цепной реакции, количественное определение уровня гетероплазмии мутаций митохондриального генома с помощью пиросеквенирования. Статистический анализ результатов данных.
  Аппаратура: конфокальный микроскоп ZeissLSM710 с камерой LSMT-PMT (Zeiss, Германия); Pt-электрод Кларка в составе прибора OxygraphPlus (Hansatech Instruments, Великобритания); наноспектрофотометре IMPLEN NanoPhotometrTM (ImplenGmbH, Германия) с использованием микрокюветы LabelGuardTM(ImplenGmbH, Германия); амплификатор PTC DNA Engine 200 (Bio-Rad, Китай); гель-документирующая система MolecularImager® GelDoc™ XR System (BioRad, Китай) при использовании ультрафиолетового фильтра; пиросеквенатор PyroMark Q96 MD (Qiagen, Германия). Построение графиков и диаграмм проводили с помощью программного пакета OriginPro 2018 SR1 версии 9.5.1.195 (OriginLabCorp., США). Статистический анализ данных проводили с помощью программного пакета Prism версии 9.1.0 (GraphPadSoftware, США)..
  Клеточная линия THP-1 была выбрана в качестве основы для создания цитоплазматических гибридных клеток. В качестве доноров митохондрий использовались тромбоциты, полученные из периферической крови пациентов. Для проверки полученных культур клеток проводилась лонг-ПЦР с последующим электрофоретическим разделением продуктов ПЦР и определение копийности ДНК с помощью красителя SYBR. На первом этапе работы была получена безмитохондриальная клеточная линия (rho0) с меньшим в 91 раз количеством копий митохондриальной ДНК по сравнению с нативной линией ТНР-1. На втором этапе были созданы две цибридные линии с высоким и низким уровнем гетероплазмии мутаций митохондриального генома. В цибридных культурах, так же, как и в нативной линии ТНР-1, количество копий мтДНК находилось примерно на одном уровне. Проведенные морфологические исследования двух цибридных линий показали, что уровень мембранного потенциала и митохондриальной массы в цибридной культуре с низкой мутационной нагрузкой, значимо превышали аналогичный уровень в культуре с высокой мутационной нагрузкой. Биохимическое исследование скорости поглощения кислорода показало, что культура с высокой мутационной нагрузкой имеет более высокий базовый уровень поглощения кислорода, максимальной и резервной дыхательных емкостей по сравнению с культурой с низкой мутационной нагрузкой, и как следствие более высокий уровень обмена АТФ и утечки протонов. Однако, общая митохондриальная эффективность двух цибридных линий примерно на одинаковом уровне. На основании полученных результатов, можно выдвинуть предположение о том, что клетки, несущие высокий уровень гетероплазмии мутаций митохондриального генома, пытаются компенсировать повышенным уровнем дыхания имеющиеся повреждения в комплексах дыхательной цепи, чтобы выйти на тот же уровень митохондриальной эффективности, что и клетки с низким уровнем гетероплазмии мутаций митохондриального генома.
  Было проанализировано 21 аутопсийных образцов каждого вида тканей, по 134 образца буккального эпителия и цельной крови, 41 образец каждого вида лейкоцитов. В каждом случае был проведен анализ вариабельности уровня гетероплазмии мутаций митохондриального генома. По литературным данным, наибольший уровень гетероплазмии мутаций мтДНК наблюдался в мышцах, несколько меньший, но также достаточно высокий - в печени и клетках буккального эпителия, значительно ниже - в сердце и крови человека. В нашем исследовании уровень гетероплазмии оказался выше в скелетной мускулатуре, по сравнению с паренхимой печени, по мутациям m.12315G>A и m.3256C>T, но ниже по мутациям m.13513G>A и m.1555А>G. По мутации m.3336T>C средний уровень гетероплазмии одинаков для скелетной мускулатуры и паренхимы печени. Согласуются с литературными данными результаты более высокой мутационной нагрузки в скелетной мускулатуре, по отношению к сердцу, по мутации m.3256C>T. При этом уровень гетероплазмии по другим мутациям имеет противоположную тенденцию или, как в случае с мутацией m.13513G>A, имеет равные значения. Что касается различий в уровне гетероплазмии между паренхимой печени и сосочковыми мышцами миокарда, то при анализе мутаций m.13513G>A и m.1555А>G подтвердились литературные данные о том, что в печени мутационная нагрузка выше по отношению к сердцу, а по мутациям m.12315G>A и m.3336T>C, наоборот, в печени уровень гетероплазмии мтДНК ниже, чем в сердце. По мутации m.3256C>T средние значения уровня гетероплазмии не отличаются.
  Полученные результаты в большинстве своем говорят о несущественном отличии уровне гетероплазмии в разных типах клеток и тканях человека. Однако, при проведении анализа во всех представленных выборках, все же были обнаружены достоверные различия в уровне гетероплазмии по тем или иным мутациям. Уровень гетероплазмии, в среднем по выборкам, был относительно мал.
  Отличия были выявлены между буккальным эпителием и цельной кровью по 3 мутациям, между нейтрофилами, моноцитами и лимфоцитами по 2 мутациям и скелетной мускулатурой, паренхимой селезенки и сосочковыми мышцами миокарда по 1 мутации. Следует отметить, что по мутации 1555А>G ни в одной из исследуемых выборок значимых отличий выявлено не было.
  Полученные автором данные могут быть использованы в клинико-диагностической практике при исследовании уровня гетероплазмии мутаций митохондриального генома.
  Созданная клеточная модель может быть введены в научно-исследовательскую работу для изучения роли мутаций митохондриального генома в механизмах клеточной дисфункции при атеросклерозе, и возможно в развитии других различных патологических процессов. 
  Область применения: теоретическая и практическая медицина.
chairman_dissertation_council.name: Людмила
chairman_dissertation_council.surname: Михалёва
chairman_dissertation_council.patronymic: Михайловна
chairman_dissertation_council.position: Директор НИИ морфологии человека им. акад. А.П. Авцына
chairman_dissertation_council.degree: Доктор медицинских наук
chairman_dissertation_council.rank: Член-корреспондент РАН
chairman_dissertation_council.wos_research_id: AAG-8330-2019
chairman_dissertation_council.scopus_author_id: 6701472396
chairman_dissertation_council.orcid: 0000-0003-2052-914X
chairman_dissertation_council.territory: РОССИЯ
organization_supervisor.name: Констанин
organization_supervisor.surname: Котенко
organization_supervisor.patronymic: Валентинович
organization_supervisor.position: Директор
organization_supervisor.territory: РОССИЯ
rubrics.code: 34.19.21
rubrics.name: Особенности поведения клеток в культуре
oecds.code: 01.06.DR
oecds.name: CELL BIOLOGY
speciality_codes.name: Генетика
speciality_codes.code: 1.5.7.
speciality_codes.name: Клеточная биология
speciality_codes.code: 1.5.22.
supervisors.fio: Постнов А.Ю.
supervisors.scientific_degree: Доктор медицинских наук
supervisors.speciality_code: Патологическая анатомия
supervisors.responsible_type: Научный руководитель
supervisors.fio: Сазонова М.А.
supervisors.scientific_degree: Кандидат биологических наук
supervisors.speciality_code: Генетика
supervisors.responsible_type: Научный руководитель
opponents.fio: Казубская Т.П.
opponents.scientific_degree: Доктор медицинских наук
opponents.speciality_code: Генетика
opponents.responsible_type: Оппонент
opponents.fio: Котелевцев Ю.В.
opponents.scientific_degree: Кандидат химических наук
opponents.speciality_code: Биоорганическая химия
opponents.responsible_type: Оппонент
protection_organization.short_name: ФГБНУ "РНЦХ ИМ. АКАД. Б.В. ПЕТРОВСКОГО"
protection_organization.name: ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "РОССИЙСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ХИРУРГИИ ИМЕНИ АКАДЕМИКА Б.В. ПЕТРОВСКОГО"
protection_organization.ogrn: 1027739267214
protection_organization.supervisor_name: КОНСТАНТИН
protection_organization.supervisor_surname: КОТЕНКО
protection_organization.supervisor_patronymic: ВАЛЕНТИНОВИЧ
protection_organization.organization_type: Организация
protection_organization.okogu: Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
protection_organization.okopf: Федеральные государственные бюджетные учреждения
author_organization.short_name: ФГБНУ "РНЦХ ИМ. АКАД. Б.В. ПЕТРОВСКОГО"
author_organization.name: ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "РОССИЙСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ХИРУРГИИ ИМЕНИ АКАДЕМИКА Б.В. ПЕТРОВСКОГО"
author_organization.ogrn: 1027739267214
author_organization.supervisor_name: КОНСТАНТИН
author_organization.supervisor_surname: КОТЕНКО
author_organization.supervisor_patronymic: ВАЛЕНТИНОВИЧ
author_organization.organization_type: Организация
author_organization.okogu: Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
author_organization.okopf: Федеральные государственные бюджетные учреждения