name: Разработка методов идентификации метагеномных сигнатур для изучения композиции генов нейроактивных соединений микробиоты кишечника детей с расстройством аутистического спектра
keyword_list: Микробиота кишечника Метагеномика Расстройства аутистического спектра Метагеномная сигнатура Нейроактивные соединения Ось микробиота-кишечник-мозг
abstract: Расстройства аутистического спектра (РАС) являются одним из наиболее серьезных нарушений развития нервной системы, частота его встречаемости стремительно увеличивается во всем мире в последние годы. Это гетерогенная группа системных патологических изменений, имеющих ряд схожих основных невропатологических симптомов комплексных нарушений (Полетаев и др., 2015; Lord et al., 2020). РАС характеризуются нарушениями в коммуникации, расстройством социального взаимодействия, поведением, характеризующимся склонностью к повторяющемуся выполнению определенных действий, и недостатками когнитивного развития в раннем детстве. На данный момент микробиоту кишечника (МК) человека рассматривают как один из факторов развития РАС у детей.
  МК – совокупность микроорганизмов, находящихся в симбиотической связи друг с другом и организмом человека. Способность бактерий МК производить большое количество метаболитов позволяет рассматривать ее как самостоятельный орган, играющий важную роль во многих процессах жизнедеятельности человека (Evans et al., 2013). Для различных представителей МК была показана способность синтезировать нейроактивные соединения, в том числе нейромедиаторы (Oleskin et al., 2019). Данное свойство микробиоты дает ей возможность не только влиять на поведение, настроение, развитие стресса, но и делает ее одним из ключевых факторов развития ЦНС и мозга у детей (Liu et al., 2019). Нарушение состава МК в первые годы жизни ребенка может негативно сказываться на ЭНС и ЦНС. Таким образом, дисбаланс МК может сопровождать развитие психических расстройств, таких как РАС. В ряде исследований у детей с РАС показано изменение концентраций различных активных соединений в крови, моче и стуле, коррелирующее с заболеванием. К ним относятся нейромедиаторы, такие как гамма-аминомасляная кислота (ГАМК, Kang et al., 2018), серотонин (Mulder et al., 2004), мелатонин (Doyen et al., 2011), а также p-крезол (De Angelis et al., 2013), пропионовая кислота (Wang et al., 2012), триптофан (Kang et al., 2018) и др. Данные соединения в то же время могут синтезироваться и бактериями МК. У пациентов с РАС также наблюдаются нарушения в таксономическом составе МК (Kang et al., 2018). Это подчеркивает важность изучения МК, как одного из факторов развития РАС у детей. Умение определять функциональные изменения в МК относительно нормы может стать важным шагом на пути к созданию методов диагностики заболевания и персонализированного подхода к его лечению.
  Данная работа проведена в лаборатории генетики микроорганизмов Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. Основной целью работы являлось определение изменений метагеномной сигнатуры, связанных с нейромодулирующим потенциалом МК, у детей с РАС возрастом 3 – 5 лет из московского региона по сравнению с группой здоровых нейротипичных детей.
  Работа проводилась в несколько этапов: 
  - создание каталога ортологов аминокислотных последовательностей ферментов, участвующих в образовании у бактерий МК нейроактивных соединений и соединений, описанных в литературе как биомаркеры РАС;
  - разработка биоинформатического алгоритма идентификации метагеномных сигнатур, а также определения статистически значимых изменений сигнатуры у пациентов с РАС;
  - определение сигнатуры, описывающей нейромодулирующий потенциал МК человека в норме;
  - определение сигнатуры, характеризующей изменения нейромодулирующего потенциала МК у детей с РАС возрастом 3 – 5 лет из московского региона.
  При создании каталога проводился анализ литературных источников с целью отбора активных соединений для исследования и ферментов, участвующих в их синтезе и метаболизме у бактерий. Для отобранных ферментов определялись референсные аминокислотные последовательности с использованием литературных источников и международных баз данных KEGG и SwissProt. После этого проводился поиск ортологов к данным референсным последовательностям среди бактерий, относящимся к 32 наиболее представленным родам МК человека. Всего в каталог вошло 405 аминокислотных последовательностей ортологов к 32 ключевым бактериальным ферментам, необходимым для образования и распада нейроактивных соединений и биомаркеров РАС, в том числе: дофамин, серотонин, гистамин, мелатонин, ГАМК; короткоцепочечные жирные кислоты: пропионовая, масляная и уксусная кислоты; ароматические аминокислоты фенилаланин, тирозин (и их предшественники префенат и 4-гидроксифенилпируват), триптофан; глутатион; уроканат; индол; p-крезол; D-изомер молочной кислоты; креатин; 4-этилфенилсульфат и тирамин.
  Далее был разработан биоинформатический алгоритм определения метагеномных сигнатур с использованием каталога ортологов. В отличие от большинства существующих методов метагеномного анализа, позволяющих определять таксономический состав микробиоты и бактериальные гены в метагеноме по отдельности, данный алгоритм описывает микробиоту по совокупности параметров – таксонам и генам, т.е. определяется, не только наличие гена, но и его бактериальное происхождение. Тем самым достигается более полная характеристика микробиоты. Объединенное множество найденных пар «таксон; ген» называется метагеномной сигнатурой. Разработанный алгоритм был создан на языке программирования Perl и представляет собой вычислительный конвейер, объединяющий как программные модули собственной разработки, так и готовые биоинформатические программы (MetaGeneMark, blast, Kraken). Алгоритм заточен на работу с данными полногеномного метагеномного секвенирования, результатом его работы является матрица, описывающая относительную представленность найденных сигнатурных пар «таксон; ген». Статистическая значимость в работе оценивалась по критерию Уилкоксона-Манна-Уитни с поправкой на множественное сравнение методом перестановок, P-value < 0.05.
  Разработанный алгоритм был использован для анализа 346 геномов бактерий, выделенных из МК человека и относящихся к ее 32 наиболее представленным родам, и 147 метагеномов МК здоровых людей. Данные для этого этапа исследования были взяты из базы данных проекта Human Microbiome Project (https://hmpdacc.org/). По результатам анализа была определена метагеномная сигнатура, описывающая МК нейромодулирующий потенциал МК человека в норме. Среди множества выявленных сигнатурных пар было выделено консервативное ядро сигнатуры, в которое вошли рода Bifidobacterium, Clostridium, Escherichia, Eubacterium, Lactobacillus, Roseburia и Ruminococcus, в которых обнаружено наибольшее число ортологов, а также 6 ферментов: глутаматдекарбоксилаза, гамма-аминобутират антипортер, серотонин-N-ацетилтрансфераза, фосфотрансацетилаза, бутирил-CoA-дегидрогеназа и метилмалонил-CoA-декарбоксилаза, участвующих в синтезе ГАМК, мелатонина, уксусной, масляной и пропионовой кислот.
  Наконец, был проведен метагеномный анализ МК детей с РАС возрастом 3 – 5 лет из московского региона. Всего в когорту вошли 57 детей, среди них 36 пациентов с РАС и 21 нейротипичный здоровый ребенок. Исследование одобрено этическим комитетом российского национального исследовательского медицинского университета имени Н.И. Пирогова (протокол № 165, 22.05.2017). Все участники исследования подтвердили свое согласие в письменной форме. Для всех образцов было проведено секвенирование полного метагенома, в результате получено более 1447.77 миллионов высоко качественных чтений.
  По результатам сравнительного таксономического анализа было выявлено пониженное альфа-разнообразие МК детей с РАС, а также значимое понижение содержания родов Barnesiella и Parabacteroides. На уровне видов в МК детей с РАС наблюдается значимое понижение представленности бактерий видов Alistipes putredinis, Bacteroides intestinihominis, Eubacterium rectale, Parabacteroides distasonis и Ruminococcus lactaris и увеличение представленности бактерий вида Bacteroides stercoris.
  Разработанный алгоритм определения сигнатур был применен для анализа 57 метагеномов. Исследование проводилось на таксономических уровнях родов и видов. В результате было выделено 3 сигнатурные пары на таксономическом уровне родов и 2 пары на уровне видов, представленность которых значимо понижается в метагеномах МК детей с РАС: «Bacteroides; глутаматдекарбоксилаза», «Bacteroides; метилмалонил-CoA-декарбоксилаза», «Roseburia; серотонин-N-ацетилтрансфераза», «Bacteroides vulgatus; фосфотрансацетилаза» и «Parabacteroides distasonis; метилмалонил-CoA-декарбоксилаза». Полученные данные составляют метагеномную сигнатуру, описывающую изменения нейрометаболического потенциала МК детей с РАС из московского региона.
chairman_dissertation_council.name: Всеволод
chairman_dissertation_council.surname: Макеев
chairman_dissertation_council.patronymic: Юрьевич
chairman_dissertation_council.position: заведующий лабораторией
chairman_dissertation_council.degree: Доктор биологических наук
chairman_dissertation_council.rank: Член-корреспондент РАН
chairman_dissertation_council.wos_research_id: E-8015-2013
chairman_dissertation_council.scopus_author_id: 7005512136
chairman_dissertation_council.orcid: 0000-0001-9405-9748
chairman_dissertation_council.territory: РОССИЯ
organization_supervisor.name: Николай
organization_supervisor.surname: Кудрявцев
organization_supervisor.patronymic: Николаевич
organization_supervisor.position: ректор
organization_supervisor.territory: РОССИЯ
rubrics.code: 34.03.23
rubrics.name: Математическая биология и теоретическое моделирование биологических процессов. Биоинформатика
oecds.code: 01.06.MC
oecds.name: MATHEMATICAL & COMPUTATIONAL BIOLOGY
speciality_codes.name: Математическая биология, биоинформатика
speciality_codes.code: 03.01.09
supervisors.fio: Даниленко В.Н.
supervisors.scientific_degree: Доктор биологических наук
supervisors.speciality_code: Микробиология
supervisors.responsible_type: Научный руководитель
opponents.fio: Поройков В.В.
opponents.scientific_degree: Доктор биологических наук
opponents.speciality_code: Биофизика
opponents.responsible_type: Оппонент
opponents.fio: Суворов А.Н.
opponents.scientific_degree: Доктор медицинских наук
opponents.speciality_code: Микробиология
opponents.responsible_type: Оппонент
opponents.fio: Равин Н.В.
opponents.scientific_degree: Доктор биологических наук
opponents.speciality_code: Вирусология
opponents.responsible_type: Оппонент
protection_organization.short_name: МФТИ
protection_organization.name: Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Московский физико-технический институт (национальный исследовательский  университет)"
protection_organization.ogrn: 1027739386135
protection_organization.organization_type: Организация
protection_organization.okogu: Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
protection_organization.okopf: Федеральные государственные автономные учреждения
author_organization.short_name: ИОГен РАН
author_organization.name: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук
author_organization.ogrn: 1037739549748
author_organization.organization_type: Организация
author_organization.okogu: Федеральное агентство научных организаций
author_organization.okopf: Федеральные государственные бюджетные учреждения